脱镁叶绿酸钠靶向结合忽视拟盘多毛孢PnCHS1的作用方式研究

[目的]研究脱镁叶绿酸钠(sodium pheophorbide a,SPA)对忽视拟盘多毛孢(Pestalotiopsis neglecta,Pn)菌丝细胞壁几丁质合成的影响,探讨脱镁叶绿酸钠与忽视拟盘多毛孢PnCHS1 的分子对接模式,明确脱镁叶绿酸钠靶向结合PnCHS1/2 的作用方式。[方法]利用Ekm-Morgari法测单氨基糖含量间接测量未经光活化的SPA处理对Pn细胞壁中几丁质含量的影响,对几丁质合成酶编码基因PnCHS1 进行原核表达,荧光定量PCR分析SPA处理对PnCHS1/2 基因相对表达的影响,通过AutoDock Vina 1.1.2 对受体蛋白与配体小分子进行分子对接,给亲和能打分,最后采用分子动力学模拟分析PnCHS1/2 蛋白与SPA分子间相互作用。[结果]不同浓度SPA处理均显著降低了Pn细胞壁中几丁质含量(P<0.05),且呈现浓度依赖型;通过基因克隆与原核表达,获得PnCHS1 基因CDS全长 2745 bp,编码 914 个氨基酸,蛋白质相对含量为101.8 kDa;基于AMBER力场的结合能预测算法,预测得配体与受体间的结合能为-10.0 kcal/mol,PnCHS1蛋白的Arg543 残基的侧链胍基N-H与小分子的羧羟基形成了两根氢键,键长分别为 3.2 Å和 3.0Å,Thr528残基的侧链羟基与小分子的酮基O形成了键长为 3.2 Å的氢键,配体结合于蛋白质的内部空腔,且自由能较低,表明配体和受体形成了较稳定的复合物;在分子动力学模拟的 100 ns过程中,SPA分子与PnCHS1蛋白之间的结合较为紧密,始终未出现脱离蛋白的现象,保持于蛋白的结合空腔内振动,与蛋白质间形成至少 1 根的氢键,结合比较紧密。[结论]SPA以细胞壁生物合成关键酶几丁质合酶蛋白PnCHS1/2 为潜在靶标,表明SPA可能存在对Pn细胞壁合成的非光依赖性抑菌作用机制。研究结果可为SPA的进一步开发应用提供新的理论依据。