大花序桉叶片器官发生与不定芽起源研究

建立大花序桉(Eucalyptus cloeziana)叶片不定芽诱导和植株形态建成的组培再生技术体系,并明确不定芽发生位置。以大花序桉良种"川林珍 7523"无性系无菌叶片为外植体,MS为基础培养基,设计以 6-BA、TDZ、CPPU以及IBA不同浓度组合的培养基为叶片愈伤组织诱导培养基;NAA、TDZ、CPPU以及IBA不同浓度组合的培养基为叶片状态转换、愈伤组织增殖、不定芽分化的培养基;探索 0～3000 Lux对大花序桉愈伤组织诱导、分化的影响;并采用石蜡切片来分析不定芽分化来源。(1)大花序桉"川林珍7523"增殖苗顶端往下第 2-4 叶片是最合适诱导愈伤组织的材料。(2)增殖苗叶片在植株形态转化培养基(MS+0.01 mg/L TDZ+0.6mg/L NAA)中培养 30 d,当幼苗顶部或新叶颜色变红,叶片顶端上没有白色颗粒状愈伤组织发生后,把幼苗转接入叶片形态转换培养基(MS+0.1 mg/L NAA+0.05 mg/L TDZ)中 15d,顶部叶片颜色由红色逐渐变为绿色,此时第 2-4 叶片的长度生长至 1cm可切下诱导愈伤组织。(3)大花序桉"川林珍 7523"最佳叶片愈伤组织诱导培养基为MS+0.05 mg/L 6-BA+0.1 mg/L TDZ+0.5 mg/L IBA,平均愈伤组织诱导率可达 81.52%,呈淡绿色,表面光滑有球状凸起,紧质且硬,愈伤组织大小与TDZ激素浓度呈负相关。(4)大花序桉"川林珍 7523"最佳愈伤组织分化培养基为 MS+0.05 mg/L TDZ+0.3 mg/L CPPU,叶片愈伤组织平均不定芽数最高 5.18±0.74 个/片,不定芽高 0.2-1 cm,不定芽在分化培养基中可长出 3-6 片叶,不定芽诱导后 20 d内转移至生根培养基中可诱导出不定根完成形态建成,若培养时间超过30 d后部分叶片出现轻微玻璃化迹象。(5)在 500 Lux光照下培养 20 d诱导愈伤组织效果高于其它组;在1500 Lux光照下培养愈伤组织分化效果较好,不定芽叶片未出现玻璃化。(6)大花序桉"川林珍 7523"叶片愈伤诱导与分化进程中石蜡切片解剖结构分析发现,愈伤组织主要来源于叶柄上半部,不定芽起源于愈伤组织表层第三层细胞,为外起源方式。本研究建立了完整的大花序桉叶片诱导和不定芽高效再生途径,为大花序桉多倍体诱导和转基因研究提供材料基础。