热胁迫下棉花 CMS-D2恢复系花粉育性相关环状 RNA 鉴定及功能初步分析

近年来，随着人工杂交制种成本的逐年提升，细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)已逐渐成为棉花杂种优势利用领域的研究热点。在棉花 CMS系中，哈克尼西棉细胞质雄性不育(CMS-D2)胞质是目前生产上推广种植的棉花“三系”杂交种的主要胞质来源。然而，其恢复系育性容易受夏季持续高温胁迫影响，这严重制约了“三系”杂交种在生产上大规模应用(尤其在夏季温度更高的长江流域棉区)。已有一些研究发现非编码 RNA参与调控植物对外界热胁迫的响应。作为一种重要的非编码 RNA类型，环状 RNA(circular RNAs,circRNAs)在基因转录和转录后调控中也发挥着重要作用。然而，关于 circRNAs在热胁迫下棉花 CMS-D2恢复系雄性育性稳定性中的调控角色目前仍未见相关报道。本研究选用一套同核异质近等基因恢复系NH(耐高温)和SH(以前命名为ZBR,高温敏感型),分别种植于黄河流域棉区河南安阳和长江流域棉区江西九江，利用高温胁迫下其成熟花粉构建去核糖体 RNA测序文库并进行转录组分析。共鉴定到967个 circRNAs,其中250 个circRNAs在高温胁迫下差异表达。随机选取12个差异表达 circRNAs(differentially expressedcircRNAs,DECs)并设计发散引物和聚合引物，以经 RNase R酶消化处理后的花粉 cDNA 为模板进行 PCR扩增和Sanger测序，其中有8个DECs的反向剪接位点得到了验证。利用半定量PCR和实时荧光定量 PCR技术分析5个已验证的 DECs在2个材料根、茎、叶和花粉中的表达模式，发现这些circRNAs在根、茎、叶中均低表达或不表达，但在花粉中相对高表达，且相比NH来说，在SH中均显著下调表达。GO功能注释和KEGG通路富集分析发现 DECs 对应的亲本基因显著富集在一些可能与花粉育性相关的生物学过程如花粉管引导、细胞壁组织、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、类固醇生物合成和N-聚糖生物合成途径等。此外，还构建了高温胁迫下棉花花粉发育相关DECs介导的竞争性内源性RNA(ceRNA)调控网络，共包含21个DECs、8个miRNAs及22个潜在mRNA靶基因。其中，circRNA346-miR159a-MYB33和 circRNA484-miR319e-MYB33 这两个 ceRNA模块可能对热胁迫下 CMS-D2恢复系花粉育性稳定性调控至关重要。本研究系统分析了棉花花粉中circRNAs 的丰度、特征、组织表达模式及其潜在功能，并初步构建了热胁迫下circRNAs参与调控 CMS-D2 恢复系花粉育性稳定性的ceRNA网络，为进一步揭示棉花 CMS-D2育性恢复机理奠定了基础，同时对生产上解决恢复系花药发育对高温胁迫敏感的育种瓶颈具有重要指导意义。